Introdução

Há diversos guias e literaturas que descrevem a validação de métodos analíticos, no entanto, comparativamente, pouco se discute a respeito da validação de métodos microbiológicos (Freitas, 2006). Por exemplo, a Farmacopéia Brasileira e algumas das principais farmacopéias internacionais apresentam pequenos parágrafos sobre a validação dos métodos microbiológicos.

Atualmente, a Farmacopéia Americana fornece guias de validação para testes microbiológicos, que compreendem os capítulos 1223 – Validação de Métodos Microbiológicos Alternativos - e o 1227 – Validação de Recuperação Microbiana a partir de Artigos Farmacopéicos. Outros capítulos, como 51 - Teste de Eficácia de Antimicrobianos -, 61 - Teste de Enumeração Microbiana -, 62 – Teste para Microrganismos Específicos - e 71 - Testes de Esterilidade, mencionados nos métodos gerais da Farmacopéia Americana, também estão relacionados com a validação, pois esses testes dependem da recuperação microbiana.

É importante ressaltar que, além da validação propriamente dita, há fatores que influenciam diretamentenos resultados microbiológicos, discutidos a seguir, além da Validação de  Recuperação Microbiana.

Fatores de influência

Antes de iniciar a validação do método microbiológico, é importante mencionar que as condições do laboratório devem seguir as boas práticas laboratoriais, pois a variabilidade conhecida nos dados microbiológicos, confiabilidade e reprodutibilidade estão diretamente relacionadas à aderência das melhores práticas. Isso compreende as seguintes atividades:
Técnica asséptica;
Preparação e controle de qualidade dos meios de cultura;
Manutenção e controle das cepas microbianas;
Manutenção e controle dos equipamentos do laboratório;
Layout do laboratório e operação;
Treinamento do pessoal envolvido;
Documentação;
Manutenção dos registros do laboratório;
Interpretação e avaliação dos dados laboratoriais.

Para a validação, considera-se alguns fatores de influência nos resultados dos testes, incluindo a natureza dos microrganismos utilizados como organismos desafios, a preparação do inóculo, as condições específicas do teste e as condições de recuperação. Portanto, esses pontos precisam ser muito bem definidos no protocolo de validação.

Deve-se utilizar microrganismos de testes compendiais que representem, ao menos, uma categoria de bactérias Gram-negativa e Gram-positiva, leveduras e bolores. A natureza dos microrganismos desafios exerce um grande efeito na resposta do agente antimicrobiano e conseqüentemente na neutralização deste para a recuperação dos inóculos.

A preparação e estocagem do microrganismo devem estar padronizadas antes de se iniciar os testespara a avaliação da ação neutralizante do produto com propriedade antimicrobiana. As condições específicas do teste, incluindo os buffers ou diluentes utilizados, luz e temperatura também são padronizadas e reproduzidas no estudo de validação.

As condições de recuperação microbiana estão entre as mais críticas para estimar o número de microrganismos presentes na solução teste. Considera-se o meio de recuperação utilizado para o crescimento dos microrganismos sobreviventes e as condições de incubação, que precisam ser ótimas para assegurar seu crescimento e resultados reprodutíveis.

Métodos de neutralização das propriedades antimicrobianas

Para realizar a validação dos métodos microbiológicos (Teste de Eficácia de Conservantes, Testes de Esterilidade, Testes de Contagem Microbiana e Testes para Microrganismos Específicos), é importante que as propriedades antimicrobianas do produto sejam neutralizadas para recuperação dos microrganismos viáveis. Essa neutralização será alcançada pelo uso de alguns métodos como  inibição química, diluição, filtração e lavagem.

Inibição química

Como se verifica na Tabela 1, alguns neutralizantes químicos apresentam toxicidade para microrganismos específicos. Apesar disso, são amplamente utilizados por sua conveniente e rápida ação. A inibição química de bactericidasé o método preferido para o Teste de Eficácia de Conservantes. O potencial de inibidores químicos será considerado na filtração por membrana e teste de esterilidade de transferência direta. Antibióticos podem não ser suscetíveis à neutralização por meios químicos, mas sim pelo tratamento enzimático, por exemplo, penicilinase. Essas enzimas são utilizadas se necessário.

Diluição

A diluição é outro método amplamente utilizado devido à concentração de um bactericida químico exercer um largo efeito em sua potência. A relação entre concentração e efeito antimicrobiano difere entre os agentes bacteridas, mas é uma constante para um agente antimicrobiano particular.
Esta relação é exponencial in nature, com a fórmula geral:
C t = k
C é a concentração, t é o tempo requerido para matar um inóculo padrão,
k é uma constante e o expoente concentração é o slope do plote do log t versus log C. Agentes antimicrobianos com altos valores de são rapidamente neutralizados por diluição, uma vez que aqueles com baixos valores de não são bons candidatos para neutralização por diluição.

Filtração por membrana

A neutralização por filtração por membrana é freqüentemente utilizada, especialmente em testes de esterilidade. Esse método entende-se pela retenção física do microrganismo na membrana filtrante e a remoção do agente antimicrobiano por meio do filtrado. A membrana é incubada para recuperação dos microrganismos viáveis. No entanto, a filtração sozinha não remove quantidade suficiente de agente bactericida para permitir o crescimento de microrganismos sobreviventes.

A aderência residual de agentes antimicrobianos na membrana filtrante inibe o crescimento. Para eliminar esses agentes, o conservante deve ser diluído ou lavado com um fluido de rinsagem. Neutralizantes químicos no fluido de rinsagem asseguram que resíduos de algum antimicrobiano na membrana não interfiram na recuperação de microrganismos viáveis.

Validação dos métodos de neutralização

A finalidade da validação é demonstrar que o método é capaz de recuperar os microrganismos potencialmente presentes na amostra e que o produto em teste ou a técnica de análise não impactam negativamente nessa recuperação. Considera-se recuperação do microrganismo, sob condições ótimas de crescimento, a produção de turvação do meio de cultura líquido ou desenvolvimento de colônia no meio sólido, ambos visíveis a olho nu.

Entende-se por inóculo a carga microbiana do(s) microrganismo(s) empregado(s) como desafio nas validações, como explicado na Tabela 2, que será no máximo 100 UFC e não excederá a 1% do volume da amostra diluída. A validação do método de neutralização das propriedades antimicrobianas do produto deve atender a dois critérios:
Eficácia do neutralizante, ou seja, o método de neutralização empregado é efetivo para neutralização das propriedades antimicrobianas do produto;
Toxicidade do neutralizante, ou seja, o neutralizante não deve impactar na recuperação dos microrganismos viáveis.

Para que se evidencie o atendimento desses dois critérios, o protocolo de validação deve comparar os resultados da recuperação por grupos de tratamento, conforme a seguir.
Grupo Teste (1) - Produto + método de neutralização + inóculo. O produto é submetido ao método
de neutralização, ou seja, um baixo nível de microrganismo desafio (menos do que 100 UFC) é inoculado para recuperação;
Grupo Controle (2) - Método de neutralização + inóculo. O método de neutralização é utilizado com
peptona ou outro diluente como solução teste;
Grupo Viabilidade (3) - Inóculo. O inóculo é utilizado sem exposição ao processo de neutralização. A recuperação similar entre o grupo teste e o grupo controle demonstra adequada eficácia do neutralizante, e a recuperação similar entre o grupo controle e o grupo viabilidade demonstra baixa toxicidade do neutralizante.

A validação consiste na realização de três ensaios independentes, em que cada microrganismo será submetido ao teste separadamente, segundo o protocolo de validação.

Recuperação em meio Agar

Utiliza-se recuperação no meio agar no Teste de Eficácia de Conservantes, nos Testes de Contagem Microbiana e nos Testes para Organismos Específicos. O número de microrganismos desafio viáveis no produto é estimado pelo cálculo da concentração de UFC por mL pelo método de contagem em placa. Os resultados do estudo de validação devem atender aos dois critérios de aceitação mencionados anteriormente se forem comparados com os grupos de tratamento (1), (2) e (3).

Cada ensaio, independente do estudo, demonstraria que a média de UFC das contagens em placas do produto testado é acima de 70%, se comparado com o controle do inóculo. Quando esse  critério não é atingido, isso pode indicar que o produto não foi adequadamente neutralizado, existe toxicidade do agente neutralizante ou ambas as condições.

Recuperação por filtração em membrana

Utiliza-se recuperação por filtração em membrana no Teste de Contagem Microbiana, nos Testes para Microrganismos Específicos e nos Testes de Esterilidade. Os grupos de tratamento (1) e (2) são realizados por filtração em membrana. O inóculo é adicionado à última porção do líquido de lavagem da membrana para comprovar a efetividade da mesma na retenção de microrganismos. Três lavagens de 100 mL cada são assumidas, mas o número e o volume das mesmas são determinados na validação. Entretanto, não aconselha-se exceder cinco lavagens de 200 mL cada, mesmo que por validação demonstre-se que esse volume de líquido não foi o suficiente para eliminar toda a atividade antimicrobiana do produto, uma vez que existe o risco do volume maior que um litro alterar a capacidade de retenção da membrana e, com isso, alterar a validade do teste. A membrana é colocada sobre um meio agar incubado para recuperação.

No grupo (3), o inóculo é plaqueado diretamente no meio sólido e comparado com o grupo (2) para comprovar que o material de constituição da membrana não é tóxico e que não há aderência de microrganismos no sistema de filtração. Nesta técnica entende-se que a amostra teste será filtrada. Caso seja necessária a utilização de solubilizante, por exemplo, para pomadas, isso deve ser considerado e determinado na recuperação dos microrganismos viáveis no estudo de validação. O método é considerado validado se, nos três ensaios independentes, a recuperação microbiana do grupo de tratamento (1) for comparável à do grupo de tratamento (2).

Recuperação em meio líquido

Utiliza-se recuperação em meio líquido no Teste de Contagem Microbiana pela técnica de número mais provável e no Teste de Esterilidade por inoculação direta. Os grupos de tratamento (1), (2) e (3) são realizados segundo o esquema proposto no protocolo de validação, sendo todos executados por inoculação em meio de cultura líquido.

O caldo utilizado deve neutralizar as propriedades antimicrobianas da solução teste e permitir o crescimento dos microrganismos. As proporções de produto e meios de recuperação variam para alcançar adequada neutralização.

O método é considerado validado se os grupos apresentarem crescimento em até sete dias para todos os microrganismos. Se isso não ocorrer, indica que o produto não foi adequadamente neutralizado, o volume de meio de cultura foi inadequado, existe toxicidade do agente neutralizador ou estão ocorrendo todas as condições.

Considerações importantes

A ausência na recuperação ou a recuperação abaixo do limite aceitável, para qualquer um dos microrganismos testados, demonstra a necessidade de modificação do teste, levando-se em consideração os métodos de neutralização. Qualquer alteração no procedimento ou do produto teste requer uma revalidação do teste. O relatório final de validação conterá todas as etapas realizadas durante o estudo (inibição química, diluição, filtração e lavagem), definido com o método de neutralização dos antimicrobianos, quando presente, até que seja eliminada.

Quando não for possível a inibição dos interferentes mesmo com o uso das alternativas de agentes neutralizantes ou métodos de neutralização, o relatório deverá conter todo o histórico de testes realizados e seus respectivos resultados, justificando tecnicamente a razão pela qual não foi  atingido o critério de aceitação.

Estimando o número de Unidades Formadoras de Colônia (UFC)

O intervalo aceito para colônias contáveis em uma placa padrão é de 25 e 250 UFC para a maioria das bactérias e Candida albicans.  Esta variação é aceitável para os microrganismos oficiais. Para os fungos a variação está entre 8 e 80 UFC por placa. Estes valores devem ser atendidos, pois a precisão de qualquer estimativa de UFC viável é afetada pelo número plaqueado. Se o número de células viáveis aumenta, diminui a precisão da estimativa devido à sobreposição de colônias. Em paralelo, se o número de células viáveis diminui, há um aumento de méerros randômicos e uma conseqüente diminuição da precisão. Para o uso de filtração por membranana recuperação de microrganismos desafio ou no uso de isolados do ambiente como microrganismos desafio nos testes de eficácia antimicrobiana, será realizada a validação das variações contáveis.

Referências Bibliográficas
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Publicado na revista Fármacos & Medicamentos 59 (Julho/Agosto/Setembro 2009)