Introdução
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de separação que, em menos de 30 anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, à possibilidade de separar espécies não-voláteis e termicamente instáveis, com destaque para a indústria farmacêutica, bem como às suas aplicações em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência, como o da medicina 1.
Escolher a melhor coluna para aplicação em uma análise requer considerações sobre a estrutura química da fase estacionária, capacidade de retenção, tamanho de partícula e dimensões da coluna. Identificar a melhor fase estacionária para uma separação é a etapa crítica da escolha da coluna e sua decisão deve ser baseada na solubilidade da amostra e nas diferenças químicas entre os compostos de interesse 2.
Considerações iniciais
Colunas de fase reversa (alquil, fenil e ciano) são eficientes para compostos hidrofóbicos. Algumas das fases estacionárias podem ser incorporadas a funcionalidades polares e apolares e também podem ser empregadas como fase reversa ou fase normal.
Enquanto as fases estacionárias de cadeia alquílica, demonstrada no exemplo C-18, são as mais utilizadas, muitas fases estacionárias novas promovem separações melhores. As fases alquílicas são as melhores para análise de compostos neutros com alta razão carbono: heteroátomos, em que a maior distinção entre os analitos é a sua hidrofobicidade. A capacidade de retenção é outra importante consideração e é influenciada pela área superficial e pela porcentagem de carbono do material empacotado na coluna. A área da superfície é inversamente proporcional ao tamanho do poro, ou seja, quanto maior o poro menor a retenção. No entanto, poros com dimensões em torno de 300A são ideais para moléculas grandes. Tamanhos de partículas e dimensões da coluna influenciam na escolha. Para selecionar o tamanho das partículas considera-se a eficiência e a pressão da coluna. Uma coluna com 3 micrômetros poderá ser 50% mais eficiente do que uma coluna de 5 micrômetros se todas as outras condições forem constantes para ambas as colunas. As dimensões da coluna incluem diâmetro interno e comprimento e a medida mais comum de diâmetro interno (ID) é de 4,6 mm. Em teoria, resolução e pressão deveriam ser independentes do ID da coluna, assim como o fluxo é ajustado para manter a velocidade da fase móvel linear.
Dentro da CLAE, estima-se que mais de 90% dos laboratórios de análise espalhados pelo mundo utilizam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa (FR) 3. Sistemas de CLAE-FR consistem em uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas. Estas fases apresentam várias vantagens, tais como utilização de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água, fases estacionárias estáveis de muitos tipos diferentes, rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel, facilidade de empregar eluição por gradiente, maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à separação de solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas 1.
Suporte
A sílica como material para fase estacionária tem sido muito utilizada nas últimas décadas, principalmente por suas vantagens como resistência a altas pressões e conhecimento de suas propriedades físico-químicas. Apesar destas vantagens fazerem com que a sílica seja amplamente utilizada em análises químicas, a mesma possui duas limitações: a falta de homogeneidade da sua superfície e a instabilidade da sílica. A falta de homogeneidade da superfície de uma fase estacionária pode causar alteração no mecanismo de retenção do analito e perda de eficiência da coluna. Isso se dá pela presença de diferentes grupos silanóis juntos, que são ácidos, interferindo no mecanismo de adsorção de analitos básicos, conseqüentemente apresentando picos largos, assimé polímeros de estireno-divinilbenzeno 11 , considerando que as duas últimas apresentam baixa resistência a altas pressões.
No caso dos óxidos inorgânicos, pode-se citar a alumina 12-14 , que possui resistência mecânica comparável à sílica e maior resistência química do que a mesma, sendo estável ao utilizar pH acima de 12, sendo capaz de separar compostos básicos sem reagente, par-iônico ou supressão iônica. Uma desvantagem na utilização da aluminia ocorre na separação de ácidos carboxílicos, pela ligação irreversível na sua superfície, e apresentam menor número de pratos teóricos menores que a sílica e não há disponibilidade comercial de variedades.
Outra opção é utilização de fases estacionárias híbridas com matriz orgânica-inorgânica 15, 16. São obtidas pela reação de um tetraalcoxissilano com um alquiltrialcoxissilano para formar um precursor. Como resultado final se obtém uma partícula contendo unidades inorgânicas (SiO2) e orgânicas (R’SiO1,5), com o grupo tricos e com cauda se a adsorção for reversível. Caso a mesma seja irreversível pode causar até mesmo a deterioração da coluna 4.
O segundo aspecto é a instabilidade da sílica e das fases estacionárias sintetizadas baseadas em sílica, tanto frente a fases móveis ácidas como básicas. Os grupos silanóis e siloxanos (Si-O-Si) reagem com estas fases móveis, sofrendo dissolução, causando perda da fase estacionária e, eventualmente, colapso da estrutura do leito da coluna 5, 6. Este problema de instabilidade em soluções de pH baixo 7 ou alto 7-9 é muito importante em CLAE-FR, sendo que soluções com pH 2,5 ou pH 9 são recomendadas 10 para a análise de diversos compostos, contendo, em sua estrutura, grupos ácidos como carboxílicos e fenólicos e básicos como aminas e amidas, tais como os encontrados, por exemplo, em fármacos e pesticidas.
Em todos esses casos, a substituição da sílica como suporte é a melhor alternativa. Essa troca pode ser feita por óxidos inorgânicos, celulose ou alquila (R’) incorporado na matriz. As fases estacionárias quimicamente ligadas obtidas dos materiais híbridos são mais estáveis do que as fases quimicamente ligadas convencionais e também apresentam um menor número de grupos silanóis, devido ao maior recobrimento superficial pelos grupos alquilas. A instabilidade da sílica e/ou da fase estacionária como um todo acontece devido à reação dos grupos silanóis e siloxanos com a fase móvel utilizada. Nesse caso ocorre a dissolução, perdendo fase estacionária, e, eventualmente, causando colapso na estrutura do leito da coluna. Esta instabilidade normalmente está ligada ao pH (geralmente os extremos) da fase móvel.
Fases reversas
Como as fases para utilização como fase reversa devem apresentar caráter apolar e a superfície dos óxidos utilizados como suporte são polares, deve-se introduzir grupos orgânicos apolares nas suas superfícies. Existem várias formas de se obter as camadas orgânicas apolares sobre a superfície dos diferentes óxidos. O método mais comum ocorre por meio da introdução de monocamadas orgânicas via reação com reagentes apropriados, produzindo as chamadas fases quimicamente ligadas. Outros envolvem o recobrimento superficial dos óxidos com polímeros orgânicos.
Fases quimicamente ligadas
A modificação da superfície da sílica e dos óxidos metálicos com a introdução de uma camada quimicamente ligada ao suporte possui como objetivo principal unir, em um material apenas, as propriedades químicas dos grupos orgânicos com a rigidez e a estabilidade térmica e hidrolítica do óxido inorgânico 1, como demonstrado na Figura 1.
Alguns exemplos de fases quimicamente ligadas disponíveis comercialmente:
C-18 - Muito retensiva para compostos apolares; C-8 - Bastante retensiva; C-4, C-3 - Menos retensivas em relação a C-18 e C-8, mas muito utilizadas para análise de proteínas e peptídeos;
C-1 - Ainda menos retensiva e pouco estável.
Alguns exemplos de fases quimicamente ligadas disponíveis comercialmente que podem ser utilizadas tanto para fase reversa quanto para fase normal:
Ciano (CN) - Moderadamente retensiva; Amino (NH2) - Retenção baixa, menos estável, muito utilizada para carboidratos; Fenil, feniletil, fenilbenzil - Moderadamente retensivas e apresentam diferenças de seletividade; Diol, glicerol - No modo normal apresenta seletividade similar à sílica e no modo reverso é utilizada para exclusão.
Fases estacionárias com polímeros adsorvidos e imobilizados sobre o suporte
Nas últimas décadas, recobrimentos de suportes óxidos com polímeros têm se tornado um método de grande importância na preparação de fases estacionárias para CLAE-FR. Considerando-se o desenvolvi - mento de fases estacionárias com camadas muito finas de polímeros (monocamadas), evidencia-se que a diferença na velocidade de transferência de massa dos solutos nas fases modernas com polímeros e nas quimicamente ligadas estão ficando cada vez mais desprezíveis.
A preparação destas fases estacionárias foi tão bem-sucedida que atualmente inúmeras delas estão sendo comercializadas. Como as colunas poliestireno Shim-pack Series (amino, ISC,ISA, SCR, IC, ION, GPC), poliacrilato Shim-pack Series (PA, IC) e álcool polivinílico Asahipak Series (GS, ES, ODP). O objetivo de produzir fases com polímeros recober tos sobre um suporte é combinar a resistência mecânica da matriz inorgânica com a seletividade e inércia química dos polímeros orgânicos. As principais vantagens das fases com polímeros sobre as quimicamente ligadas são: maior recobrimento dos sítios ativos do suporte e a possibilidade de maior seletividade da fase estacionária pela escolha do polímero apropriado. A seletividade é influenciada pela natureza e pela quantidade de grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, pela espessura do filme polimérico, pela área superficial e pela estrutura de poros do suporte. A imensa variedade de polímeros orgânicos disponíveis possibilita preparar fases com grande faixa de seletividade 1.
Economia de tempo e solvente
Ao longo dos anos, a cromatografia líquida tem sido considerada técnica analítica de alto nível em relação às demais e muito se tem feito para o seu aprimoramento, como o desenvolvimento de técnicas como Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) e, mais recentemente, a Ultra Fast Liquid Chromatography (UFLC). Esta última emprega um comprovado mecanismo de distribuição de solventes, com fluxo de 3.7 nL/min e taxa de resolução 10uL/stroke, com passagem de fase móvel muito rápida, conseqüentemente utilizando colunas menores e consumindo menor quantidade de solvente.
Atualmente, devido à preocupação com o meio ambiente, estas técnicas tornam-se cada vez mais necessárias, pois além da preocupação em reduzir os custos de análise, ainda há necessidade de se minimizar a utilização de solventes orgânicos, gerando menor quantidade de resíduos. Hoje, o mercado enfrenta problemas com a crise no fornecimento de acetonitrila grau HPLC. Este solvente tem sido preferido no desenvolvimento de métodos cromatográficos em fase reversa devido à sua maior transparência na região de 195 a 220 nm do espectro, menos viscosidade, maior força cromatográfica e boa miscibilidade em água. Sendo assim, os fabricantes de suprimentos disponibilizam no mercado colunas com as mesmas características químicas citadas anteriormente, mas com tamanho reduzido.
Colunas C-8 e C-18, como a Chromoltih, com diâmetro interno de 3 mm, além de diminuir a quantidade de solvente utilizada, ainda propõe a troca da acetonitrila por metanol, mantendo o mesmo padrão de separação, além de ser adaptada em equipamentos de HPLC além de UPLC 17. Colunas como Shim-pack XR-ODS com tamanho de partícula de 2 mm e menor pressão se comparada com outras colunas comerciais com o mesmo tamanho de partícula, reduzem o gasto de solvente em 1/5 sem sacrificar a eficiência da separação 18. Ainda colunas do tipo Ultra C-8, C-18, ciano, amino e phenil também estão disponíveis comercialmente para redução de gasto de solventes 2.
Considerações finais
De modo geral, as fases estacionárias quimicamente ligadas, do tipo monoméricas, produzem colunas com maior eficiência, sendo que são monocamadas verdadeiras. As fases quimicamente ligadas, do tipo poliméricas, promovem colunas mais estáveis às condições variadas de fases móveis e com maiores seletividades, pois promovem melhor recobrimento dos suportes 1.
A fase estacionária ideal é aquela que une a mínima espessura do recobrimento com a máxima proteção superficial do suporte. As fases que mais se aproximam deste ideal são aquelas obtidas pelo processo de entrecruzamento horizontal e pelo método de hidreto intermediário, bem como as produzidas pela adsorção/imobilização de polímeros pré-formados sobre os diferentes óxidos inorgânicos 1. A sílica ainda é o óxido mais utilizado como suporte para os mais diversos tipos de recobrimentos. Nos recobrimentos obtidos por ligação química, está relacionado com a maior estabilidade hidrolítica das ligações dos tipos Si-O-Si ou Si-C com o suporte de sílica. Mas, para o recobrimento com polímeros préformados ou preparados in situ, a sílica somente prevalece pela sua grande variedade comercial, pois a sílica metalizada e os demais óxidos apresentam propriedades físicoquímicas até mais apropriadas do que a sílica para este fim 1.
A cromatografia líquida é uma técnica em constante evolução buscando sempre melhorar a eficiência da separação entre as inúmeras classes de compostos e proporcionar economia de solvente.
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