Infecções bacterianas têm sido tratadas com antibióticos por mais de 60 anos. A descoberta da penicilina por Fleming, em 1928, certamente está entre os mais importantes marcos da humanidade. No entanto, entre a descoberta do princípio ativo e o uso difundido deste medicamento, passaram-se mais de 15 anos, o que mostra a dificuldade do desenvolvimento de bioprocessos para a produção de produtos deste gênero. Devido à complexidade do tema, mesmo com todas as facilidades geradas pelos avanços tecnológicos nos vários setores ao longo dos anos, observa-se ainda na atualidade dificuldades no desenvolvimento de tecnologias associadas com a produção de novos bioprodutos.
Dentre os antibióticos mais comercializados mundialmente, destacam-se os beta-lactâmicos, merecendo destaque as penicilinas, cefalosporinas e cefamicinas, naturais e semi-sintéticas.
Penicilinas e cefalosporinas naturais são produzidas industrialmente por via biossintética a partir de linhagens dos gêneros Penicillium e Cephalosporium. Esses antibióticos são denominados beta-lactâmicos por apresentarem na sua estrutura molecular um anel homônimo, e vêm sendo utilizados como matérias-primas na produção de antibióticos semi-sintéticos (Vandamme, 1984).
Segundo Elander (2003), o mercado mundial de antibióticos beta-lactâmicos gira em torno de 15 bilhões de dólares, correspondendo a 65% do mercado global de antibióticos. Desse montante, cerca de 5 bilhões de dólares são devidos às penicilinas e 10 bilhões de dólares às cefalosporinas e cefamicinas.
Informações obtidas junto ao Ministério de Desenvolvimento, Indústria e Comércio (http:/www.aliceweb. gov.br) , mostram que nos últimos 5 anos (2002 – 2007), o Brasil importou cerca de 71 milhões de dólares (aprox. 1,7 ton) em medicamentos baseados em penicilinas naturais e derivados e cerca de 174,5 milhões de dólares (aprox. 1,6 ton) em compostos com base em cefalosporinas e cefamicinas naturais e semi-sintéticas.
Embora os antibióticos beta-lactâmicos tradicionais apresentem grande eficácia no combate à maioria das bactérias patogênicas, ao longo dos anos algumas linhagens foram desenvolvendo resistência a estes antibióticos. Uma das formas de resistência microbiana a penicilinas e cefalosporinas deve-se à capacidade de algumas bactérias patogênicas de sintetizar Betalactamases, enzimas responsáveis pela clivagem do anel beta-lactâmico, resultando na perda da ação antibacteriana desses compostos.
“Os antibióticos estão perdendo a luta contra as bactérias, o que pode ser notado pelo ressurgimento de epidemias de pneumonia no mundo inteiro e do aumento de casos de tuberculose. A razão disso é que os mecanismos de resistência fazem parte do próprio genoma das bactérias, o que faz com que haja mutação espontânea seguida de seleção natural das Mais aptas” (Prof. Edmar Chartone de Souza - UFMG, 49a Reunião da SBPC, Folha de São Paulo, 16/07/97).
Na década de 1970, dada a preocupação com o crescente aumento da resistência bacteriana a antibióticos beta-lactâmicos, duas grandes frentes de pesquisa foram organizadas, uma na busca de novos compostos antibióticos resistentes a beta-lactamases e a segunda na descoberta de substâncias inibidoras de beta-lactamases para serem administradas em conjunto com antibióticos beta-lactâmicos. Como resultado da primeira frente de pesquisa, foi descoberta a cefamicina C ou 7-alfa metoxi-cefalosporina C de culturas de Streptomyces sp. Por pesquisadores da Merck. A descoberta da cefamicina C representa um marco no desenvolvimento dos antibióticos. Pela primeira vez, uma molécula com atividade antibacteriana mostrou-se resistente beta-lactamases de bactérias Gram negativas. A cefamicina C não é utilizada clinicamente, porém é a molécula precursora de vários antibióticos de importância terapêutica, chamados de cefâmicos (Elander, 2003). Paralelamente, um grupo de pesquisadores da então Beecham Pharmaceutical Research Divison elaboraram um programa de seleção e isolamento de culturas microbianas produtoras de inibidores de beta-lactamases. Foram realizados testes de inibição do crescimento da bactéria Klebsiella aerogenes, resistente à benzilpenicilina, utilizando-se este antibiótico em conjunto com culturas supostamente produtoras de inibidores de beta-lactamases. Uma das culturas microbianas que apresentou uma resposta positiva foi a da bactéria Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064) (Brown et al., 1976). Foi constatado que, embora a estrutura química do componente ativo da cultura filtrada apresentasse alguma semelhança à das cefalosporinas sintetizadas por linhagens desta bactéria, seu modo de ação antimicrobiana era significativamente diferente. Este novo composto biologicamente ativo foi denominado ácido clavulânico (Reading e Cole, 1977).
Dada a importância da cefamicina C e do ácido clavulânico, amplamente utilizados como matérias-primas para a produção de diversos produtos comerciais empregados no combate de infecções, e em virtude dos vultosos números relacionados com a importação de antibióticos beta-lactâmicos, o desenvolvimento de tecnologias nacionais para fins industriais, relacionadas com processos de produção desses compostos, pode ser considerado como estratégico para o País.
Nesse sentido, os componentes do Grupo de Pesquisa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Engenharia dos Processos Biológicos, envolvendo o grupo de Engenharia Bioquímica do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Car los (DEQ/UFSCar) e pesquisadores do Instituto de Química da Universidade Paulista Júlio de Mesquita (IQ/UNESP) Araraquara e Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade de Campinas (FEA/UNICAMP), baseando-se em sua experiência e competência na área, acordaram em desenvolver o projeto de pesquisa Produção e purificação de ácido clavulânico, cefamicina C e outros metabólitos bioativos de Streptomyces O Projeto iniciou-se em 2006, com forte apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e, também, por meio de Bolsas e Taxas de Bancada do CNPq e da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Esse grupo desenvolve atividades em linhas de pesquisa sobre Produção de Antibióticos Beta-Lactâmicos em Biorreatores Convencionais e não Convencionais, iniciados em 1989, bem como sobre Separação e Purificação de Antibióticos Beta-Lactâmicos, desde 2001. Estuda também Biorreatores como Operação Unitária desde 1999, destacando-se trabalhos em biorreatores não convencionais, e.g., tipo torre com células imobilizadas e tipo air-lift de circulação interna.
A experiência adquirida e os bons resultados alcançados levaram o grupo a decidir pela proposição de um projeto temático buscando o desenvolvimento de tecnologias, para fins industriais, de produçãoe purificação de ácido clavulânico e cefamicina C, moléculas recentemente incorporadas ao mercado mundial de fármacos. Também buscará isolar, identificar e caracterizar novos compostos de Actinomicetos do gênero Streptomyces, que se caracterizam por produzir metabólitos secundários com uma ampla diversidade estrutural incluindo não só substâncias antibacterianas, antifúngicas, antivirais e antitumorais, como também moléculas com propriedades imunossupressoras, anti-hipertensivas e anti-hipercolesterolêmicas. Streptomyces é uma excelente fonte de metabólitos secundários em que intermediários comuns na célula (aminoácidos, carboidratos, ácidos graxos etc.) são condensados a estruturas complexas por meio de passos bioquímicos definidos (Omura et al., 2001.) A produção de metabólitos secundários produzidos por Streptomyces podem ser associados à morfologia durante fase específica de seu crescimento, tal como descrito por Giudici et al. (2004), na produção de importante substância antitumoral, salientando-se a importância de modelos que expliquem o processo de produção e que, portanto, auxiliem na otimização do mesmo.
Ácido clavulânico
O ácido (2R,5R,Z))-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4-oxa-1-azabiciclo-[3,2,0]-heptano-2-carboxílico é nomeado ácido clavulânico de acordo com a International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Este possui uma estrutura molecular formada por dois anéis, o beta-lactâmico e o anel oxazolidínico. A massa molar do ácido clavulânico é de aproximadamente 199 Da.
O mecanismo mais importante que confere resistência a vários microrganismos patogênicos aos antibióticos beta-lactâmicos é a ação de betalactamases produzidas por estes microrganismos. O ácido clavulânico, apesar de possuir uma fraca atividade antibiótica é um potente inibidor de beta-lactamases, reagindo irreversivelmente com o sítio ativo destas enzimas, sendo a única substância comercialmente disponível para reverter o fenômeno da resistência a antibióticos beta-lactâmicos. Desta maneira tornou possível a cura de várias infecções recalcitrantes a terapias convencionais, sem necessitar de utilização de medicamentos com fortes efeitos colaterais.
O ácido clavulânico é comercializado no mercado farmacêutico por aproximadamente 1500 US$/ kg, tal como citado por Roubos (2002). Como reagente químico, a Sigma – Aldrich (Prod.Nb P3494) iniciou este ano sua comercialização – 100mg de Clavulanato de Potássio de S. clavuligerus ao preço de US$128,80. Atualmente só o ácido clavulânico representa um mercado de multi-billion-US$ per annum product segundo cita literalmente Jensen et al. (2004) em seu trabalho com colaboração de pesquisadores da GlaxoSmithKline Pharmaceuticals da Inglaterra. Neste mesmo trabalho citam que a espécie Streptomyces clavuligerus é utilizada industrialmente para sua produção. Saliente-se também que este fármaco é produzido apenas em alguns países da Europa, e.g. Portugal, Reino Unido e Suécia. O método de uso terapêutico deste produto, qual seja, quatro partes de amoxicilina (penicilina semi-sintética) com uma parte de clavulanato de potássio (500mg/125mg, por exemplo), está patenteado no exterior pela GlaxoSmithKline (GSK), onde é comercializado com o nome de Augmentin cujas vendas em 2004 atingiram quase 2,6 bilhões de dólares, sendo este medicamento responsável por 87% das vendas de antibióticos desta empresa (http://www.gsk.com/financial/rpt_q42004.
htm, acesso em 18/02/2005). Atualmente, no Brasil, é comercializado pela SmithKline Beecham do Brasil Ltda. com o nome de Clavulin.
S. clavuligerus foi relatado pela primeira vez como nova espécie por Higgens e Kastner (1971), que descreveram a nova espécie como capaz de produzir dois novos antibióticos cefalosporânicos, tendo sido isolada de amostras de solos da América do Sul. Em junho de 1976, pesquisadores da então Beecham Pharmaceuticals, Research Division, Inglaterra, em uma Communication to the editor relatam o isolamento de certas “substâncias de ocorrência natural” com atividade inibidora de betalactamases (Brown et al. 1976). Os isolados foram chamados de MM 141151, MM 4550 e MM 13902 (Belgian Patents 827.926, 827.331 e 827.332), sendo que o isolado MM 141151, produzido por S. clavuligerus ATCC 27064, foi chamado de ácido clavulânico, devido à sua origem. Cerca de uma década depois, inicia-se o processo de sua produção e comercialização. Estudos recentes, envolvendo incorporação de precursores marcados com isótopos, isolamento de enzimas juntamente com a obtenção de mutantes auxotróficos argB-2 e argC-2, revelaram uma seqüência biossintética completamente diferente daquela de outros betalactâmicos, isto é, não envolve a formação do trípetídeo alfa aminoadipato-cisteína-valina (ACV), intermediário comum nos passos metabólicos de penicilinas, cefalosporinas e cefamicinas. Estudos químicos, bioquímicos, genéticos e de biologia molecular ainda são devidos para comprovar definitivamente os passos metabólicos e elucidar os mecanismos regulatórios de sua biossíntese (Thomas, 2004).
Cefamicina C
A cefamicina C é uma substância beta-lactâmica inicialmente isolada de S. clavuligerus como um inibidor da síntese de parede celular (Omstead et al., 1985). Posteriormente verificou-se que, além de possuir alguma atividade contra bactérias Gram negativas, era resistente a ação de beta-lactamases. Esta resistência deve-se a presença do grupo 7-alfa-metóxico que estabiliza a estrutura do anel beta-lactâmico.
Antibióticos semi-sintéticos derivados da cefamicina C como a Cefoxitina e Cefotetan, possuem um amplo espectro de ação antimicrobiana, tornando-se ativo também contra bactérias Gram positivas. Em virtude da alta resistência à ação de beta-lactamases e da potente atividade antibacteriana, pode até ocorrer que as cefamicinas superem as penicilinas e as cefalosporinas no mercado de antibióticos (Sridhar, 2002).
A descoberta da cefamicina C representa um marco no desenvolvimento dos antibióticos. Pela primeira vez, uma molécula com atividade antibacteriana mostrou-se resistente a beta-actamases de bactérias Gram negativas. A cefamicina C não é utilizada clinicamente, porém é o precursor de vários antibióticos de importância terapêutica, chamados de cefâmicos. S. clavuligerus, amplamente estudado por Liras (1999), é dos mais utilizados industrialmente, tendo a capacidade de sintetizar também o ácido clavulânico. Porém, diferentemente do ácido clavulânico, o passo metabólico de sua síntese já é conhecido, tendo várias etapas em comum com aquelas da síntese de cefalosporina, incluindo a formação do tripepitídeo ACV como intermediário (Liras, 1999). Além disso, Tunca et al. (2004), já inicia estudos visando compreender melhor o mecanismo regulatório de sua síntese. Industrialmente, a cefamicina C é produzida por grandes empresas farmacêuticas como a Eli Lilly & Co., Merck & Co., Takeda Industries e Otsuka Pharmaceuticals (Sridhar, 2002). Segundo Demain e Elander (1999), a maioria dos processos de produção de cefamicina C utilizam agentes da ordem dos Actinomyces, sendo que apenas a Merck & Co., Inc. emprega Nocardia lactamdurans. Ressalte-se que a cefamicina C é um produto que, segundo Demain (2005), é produzido por fermentação, para depois ser transformado quimicamente. Além do mais não está disponível comercialmente nem mesmo sob a forma de reagente, tornando imprescindível seu isolamento e caracterização para viabilizar estudos de processos de produção.
Desenvolvimento de processos fermentativos
Os processos industriais que envolvem a produção de bioprodutos por fermentação, entre os quais se incluem as produções de diversos antibióticos, envolvem uma seqüência ordenada de etapas até a obtenção do produto final com grau de pureza necessário. A etapa de produção propriamente dita, onde constituintes do meio de cultura são convertidos em células e produto, ocorre em equipamentos denominados biorreatores ou fermentadores. A seqüência de etapas que precedem a etapa de fermentação são denominadas etapas de preparação ou up-stream e as etapas posteriores a de geração do produto são denominadas etapas de separação e purificação ou down-stream.
Dentre as várias etapas de preparação, pode-se citar o preparo e a esterilização do meio de cultura, a esterilização do ar e o preparo do inóculo. Após a etapa fermentativa, seguem as etapas de separação e purificação do produto, envolvendo operações unitárias como centrifugação, filtração, ultrafiltração, microfiltração, extração por solvente orgânico, adsorção e cristalização, entre outras.
O desenvolvimento tradicional de processos fermentativos é usualmente executado em três estágios ou escalas, a saber, escala de bancada, escala piloto e escala industrial. Na escala de bancada, tendo em vista sua maior flexibilidade e menor custo de operação, os dados básicos sobre o processo devem ser levantados dentro do maior nível de detalhes possível. No que diz respeito à etapa fermentativa, nessa escala são realizadas tarefas básicas como a seleção do microrganismo e o desenvolvimento do meio de cultura ideal. São também escolhidas as condições de temperatura e pH para o processo, assim como a forma de operação do biorreator.
Caso o processo seja aeróbio, deve-se conhecer a velocidade de consumo de oxigênio a fim de que se possa dimensionar adequadamente o sistema de transferência de oxigênio. Ainda, este levantamento de dados deve permitir a elaboração de modelos matemáticos, a fim de se poder visualizar o desempenho do processo em condições não pesquisadas experimentalmente, por meio da simulação do modelo, o que também auxilia o raciocínio nas etapas subseqüentes (Badino e Schmidell, 2001). Nessa escala também são estudadas em detalhes as diferentes operações de separação e purificação na busca de uma seqüência otimizada de operações que defina um protocolo de isolamento para o produto, para ser aplicado em escalas de trabalho superiores como a piloto e a industrial. São escolhidos os tipos de membranas e colunas mais apropriadas, obtidas informações termodinâmicas da etapa de extração por solventes, bem como definidas as melhores condições experimentais com base em parâmetros do processo como pressão transmembrana, temperatura, concentrações e vazões de operação, entre outros.
Uma vez que se tenha acumulado suficiente experiência sobre o processo fermentativo em questão, e desde que se tenha atingido desempenho adequado do ponto de vista econômico, pretende-se ampliar a escala para uma escala piloto. Como agora a operação é mais onerosa, deve-se manter constante grande parte das variáveis. Com base no conhecimento acumulado do processo, deve-se definir determinados critérios ou parâmetros de ampliação de escala, ou seja, determinadas grandezas que deverão manter-se constantes na escala piloto em relação aos valores empregados na escala de bancada. Como exemplo, durante a etapa fermentativa pode-se pensar em manter constante o cisalhamento no reator, caso as células sejam sensíveis a ele, ou manter-se constante a transferência de oxigênio, no caso de cultivos de células aeróbias.
A escala industrial, devido à própria dimensão, visa o lado econômico do processo, ou seja, a produção em grande escala, onde se procura operar o processo sob condições similares às ajustadas na escala piloto, as quais permitiram a obtenção de um desempenho adequado das várias etapas envolvidas.
Em suma, embora cada uma das escalas tenha sua devida importância no desenvolvimento de processos fermentativos, pode-se constatar que o sucesso do desenvolvimento de um bioprocesso tem sua origem na escala de bancada, onde são obtidas as informações cruciais das várias etapas envolvidas.
Produção de antibióticos betalactâmicos em escala de bancada
O projeto que vem sendo desenvolvido desde 2006 tem como objetivo o estudo das diversas etapas necessárias para o desenvolvimento de biotecnologia de produção de produtos bioativos obtidos de Streptomyces, entre eles o ácido clavulânico e a cefamicina C, para os quais pretende-se propor alternativas de todo o processo de produção, envolvendo desde melhoramento genético, desenvolvimento de bioprocessos e biorreatores, até o desenvolvimento de sistemas de separação, extração e purificação. Pretende-se realizar a análise, modelagem e simulação do processo fermentativo e das etapas de downstream. As possíveis tecnologias a serem desenvolvidas serão disponibilizadas para exploração comercial pelo setor produtivo. Espera-se também que algumas dessas alternativas possam ser utilizadas para outros compostos bioativos a serem isolados.
Para tanto quatro instituições estarão diretamente envolvidas: IQ/UNESP, FEA/UNICAMP, DEQ/UFSCar e AB/IPT. Além disso, atuarão como colaboradores em áreas específicas, o DQ/UFSCar e instituições no exterior. Na seqüência são apresentados os subprojetos (SP) que compõem o projeto temático proposto, bem como o objetivo de cada uma das etapas a serem desenvolvidas.
SP1. Melhoramento genético de linhagem produtora por métodos clássicos e utilizando técnicas baseadas na biologia molecular
Objetivos: melhoramento da produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 por meio da obtenção de clones melhorados geneticamente por via clássica. Investigação de mutantes com baixa produção de ácido clavulânico com relação à produção de cefamicina C. Estudo da linhagem Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 por meio de técnicas de biologia molecular, em relação aos genes regulatórios da via biossíntetica do ácido clavulânico e cefamicina C. Detecção de outros metabólitos bioativos a partir de Streptomyces: antibióticos beta-lactâmicos, substâncias com atividade anti-beta-lactamase e substâncias com atividade antitumoral.
SP2. Isolamento, purificação e caracterização e de ácido clavulânico e cefamicina C outros compostos bioativos de estreptomicetos Objetivos: escolha de solventes para extração, avaliação por cromatografia de camada delgada do caldo, separação e purificação por cromatografia em colunas e por HPLC para fins de caracterização e caracterização por análise instrumental.
SP3. Desenvolvimento de bioprocessos para produção de ácido clavulânico, de cefamicina C e de metabólitos secundários bioativos
Objetivos: Produção de ácido clavulânico e de cefamicina C em processo contínuo com reciclo celular e comparação de seu desempenho com processos em batelada, batelada alimentada e contínuo, em biorreatores convencionais e não convencionais e ampliação de escala. Produção de outros metabólitos bioativos em frascos agitados e em biorreator de bancada.
SP4. Estudo de alternativas para processo de separação e purificação de ácido clavulânico e cefamicina C envolvendo extração por solvente; extração em sistema de duas fases aquosas, purificação em colunas com resinas de troca iônica e neutras, utilização de zeólitas como peneira molecular e utilização de microfiltração, ultrafiltração e nanofiltração
Objetivos: estabelecimento de métodos eficazes de extração e purificação de compostos beta-lactâmicos, de modo a se constituírem em tecnologias para produção industrial. A participação da indústria farmacêutica nacional seria muito interessante para o pleno desenvolvimento do projeto, pois possibilitaria adequar as alternativas tecnológicas a serem desenvolvidas ao tamanho de mercado que se espera atingir, bem como de que produtos específicos estaria mais interessada em explorar.
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Publicado na Revista Fármacos & Medicamentos 47 (Julho/Agosto 2007)
